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常見(jiàn)問(wèn)題及解答
發(fā)布時(shí)間： 2009-12-18 點(diǎn)擊次數(shù)： 2547次1.如何測(cè)定引物的OD值？
用紫外分光光度計(jì)在260nm波長(zhǎng)測(cè)定溶液的吸光度來(lái)定量，請(qǐng)注意紫外分光光度計(jì)的使用，測(cè)定時(shí)溶液的吸光度稀釋到0.2-0.8之間（吸光度太高或太低會(huì)有較大的誤差）。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標(biāo)準(zhǔn)比色皿中測(cè)定其吸光度，即為所測(cè)體積的OD值，進(jìn)而可以計(jì)算出母液的OD值。
舉例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml并在1ml標(biāo)準(zhǔn)比色杯中測(cè)定的吸光度為0.25，說(shuō)明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說(shuō)明原來(lái)1ml母液中含有5OD的DNA。2.怎樣溶解引物？
我們的的合成報(bào)告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實(shí)驗(yàn)需要加入適量的無(wú)核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH 7.5-8.0），開(kāi)啟瓶蓋溶解之前在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘 的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，防止開(kāi)蓋時(shí)引物散失。3.合成的引物應(yīng)如何保存?
沒(méi)有溶解的引物非常穩(wěn)定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲(chǔ)存液，分裝數(shù)份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復(fù)多次凍融會(huì)降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.如何檢測(cè)引物的純度？
實(shí)驗(yàn)室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,<12個(gè)堿基的引物用20%的膠，12-60個(gè)堿基的引物用16%的膠，>60個(gè)堿基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95oC,2mins）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后（約2-3小時(shí)），剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒(méi)有雜帶，說(shuō)明純度是好的（有時(shí)由于變性不充分，主帶之上可能會(huì)有條帶，乃是引物二級(jí)結(jié)構(gòu)條帶）。5.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基團(tuán)嗎?
沒(méi)有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加磷酸基團(tuán)，訂貨時(shí)請(qǐng)?zhí)貏e注明，此時(shí)需收取磷酸化的費(fèi)用。6.合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)無(wú)目的帶，怎么辦?
PCR反應(yīng)失敗的原因很多，可以從以下幾個(gè)方面考慮。
1） 引物和模板是否配對(duì)，同源性有多大?
2） 引物本身是否有立體結(jié)構(gòu).
3） PCR反應(yīng)用試劑是否能正常工作?
4） PCR儀是否工作正常?
5） PCR反應(yīng)條件是否合適?
如果一切正常，還無(wú)法解決問(wèn)題時(shí)，我們可以免費(fèi)重新合成引物。7.測(cè)定了引物的OD值后發(fā)現(xiàn)A260/A280<1.8，引物的純度合格嗎?
由于核酸在260nm附近有強(qiáng)吸收，而蛋白質(zhì)在280nm附近有強(qiáng)吸收，從生物體內(nèi)提取核酸時(shí)，常用A260/A280比值來(lái)評(píng)價(jià)核酸純度（比值在1.8～2.0之間），這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時(shí)的結(jié)果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 （通常在20～30個(gè)堿基之間），其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數(shù)不同，因此不同堿基構(gòu)成的引物的A260/A280比值也不同， 例如當(dāng)序列中C、T堿基的含量高時(shí)，該比值會(huì)大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來(lái)判斷引物的純度.8.上海生工公司可以合成多長(zhǎng)的序列？
由于用戶(hù)和基因拼接的要求，我們很好地合成過(guò)不少100堿基左右長(zhǎng)度的長(zhǎng)片段。因?yàn)槲覀兛梢蕴岣咂鹗己铣蓴?shù)量、加大合成用的試劑量、用PAGE純化。如果您的實(shí)驗(yàn)需要，我們?cè)敢饨邮?10堿基以下的訂單。9.PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)克隆以后測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)與合成序列不相符合，怎么辦？
我們認(rèn)為這多數(shù)是PCR過(guò)程和克隆過(guò)程中引入的錯(cuò)誤。遇到這種情況，請(qǐng)您：
1） 可以要求我們重新免費(fèi)合成引物。
2） 重新挑取克隆測(cè)序，會(huì)有找到正確克隆的可能.10.如何將兩條互補(bǔ)的單鏈退火形成雙鏈？
用退火緩沖液（10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA）溶解引物, 將要退火的引物等摩爾數(shù)混合，總體積不要超過(guò)500微升，加熱到95℃ 2mins，然后緩慢冷卻至室溫（低于30度）即可。退火的產(chǎn)物可以放在4度待用。11.使用3%的Agarose凝膠電泳分析合成的引物，發(fā)現(xiàn)有很多條泳帶，為什么?
對(duì)引物進(jìn)行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA，容易形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行Agarose電泳時(shí)，容易出現(xiàn)多條泳帶，更無(wú)法用Agarose電泳進(jìn)行定量了。12.能否根據(jù)引物電泳后EB染色后條帶的亮度對(duì)合成的引物進(jìn)行定量?
不能。因?yàn)镋B是通過(guò)嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈，只有通過(guò)自身回折形成局部發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)或鏈間形成部分雙螺旋結(jié)構(gòu)，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據(jù)EB染色帶的亮度來(lái)對(duì)合成的DNA進(jìn)行定量。13.2OD的引物可以多少做次PCR反應(yīng)？
一般來(lái)講，20個(gè)堿基左右的2OD的引物zui少可以做400次PCR反應(yīng)。14. DNA合成粗產(chǎn)物中含有什么雜質(zhì)？
DNA合成儀合成的粗產(chǎn)物，其中除了含有所需的目的DNA片段以外，還含有合成反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的目的片段短的失敗片段以及脫保護(hù)基團(tuán)產(chǎn)生的銨鹽，本公司提供的引物已全部通過(guò)純化去除短片段、通過(guò)脫鹽去除鹽分。15.引物在常溫下運(yùn)輸，會(huì)降解嗎？
不會(huì)降解，干燥的引物在常溫至少可以穩(wěn)定存放二周以上。而一般的運(yùn)輸時(shí)間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會(huì)降解。16.為何長(zhǎng)鏈引物的收費(fèi)要比短鏈引物要高？
通常在合成長(zhǎng)鏈引物時(shí)，試劑的加入量要比短鏈引物要多很多，尤其是大于90bp的堿基以上的引物，由于成本的增加，從而導(dǎo)致價(jià)格也要高一些。
PCR產(chǎn)物DNA測(cè)序錯(cuò)誤的原因
一、Taq酶原因本公司現(xiàn)為世界上zui大的合成DNA專(zhuān)業(yè)公司之一,每天為世界各地用戶(hù)合成約2100條引物。在這些大量的引物中大多用于PCR擴(kuò)增,約有萬(wàn)分之五左右的在DNA測(cè)序后,發(fā)現(xiàn)在引物部分有錯(cuò)誤,錯(cuò)誤大部分表現(xiàn)為丟失。許多用戶(hù)認(rèn)為這種錯(cuò)誤是我們公司合成錯(cuò)誤造成的。 實(shí)際上這種錯(cuò)誤是由于Taq酶固有的錯(cuò)誤概率造成的,與合成無(wú)關(guān)。請(qǐng)看如下示意圖:
從圖可以清楚的看出，引物部分也被Taq擴(kuò)增，既然引物也被擴(kuò)增，那么錯(cuò)誤就可能發(fā)生。 那么化學(xué)合成DNA會(huì)不會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤呢? 回答是否定的。 錯(cuò)誤無(wú)非有兩種:一是堿基被置換；二是堿基丟失。本公司的80多臺(tái)DNA合成儀全部為ABI公司產(chǎn)品，ABI的DNA合成儀是世界上zui可靠的，至今尚未聽(tīng)說(shuō)過(guò)ABI的DNA合成儀在合成一個(gè)堿基時(shí)（例如A），卻錯(cuò)誤地加上另一個(gè)堿基（G,C or T），丟失更不可能。因?yàn)镈NA合成是在固相上進(jìn)行的，每一個(gè)堿基的合成包含了脫保護(hù)基（DMT）、堿基的加成、蓋帽（Capping）、氧化等步驟。如果說(shuō)某一個(gè)堿基由于種種原因（如瓶中溶液沒(méi)有了，或管道堵塞），未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一個(gè)反應(yīng)Capping將會(huì)把Oligo封死，使整個(gè)oligo合成立即中止。 可見(jiàn)，以上PCR產(chǎn)物測(cè)序時(shí)發(fā)生在引物部分的錯(cuò)誤不是引物合成的失誤，而是Taq酶造成的。
二、化學(xué)原因
在合成過(guò)程中，如果本公司提供的DNA合成報(bào)告單是正確的，表示合成是成功的。人為因素造成堿基突變的可能性是*可以排除的。DNA合成專(zhuān)家Dr. Hecker和Dr. Rill對(duì)此作了一評(píng)論 （Error Analysis of Chemically Synthesized Polynucleotides Biotechniques，1998.Feb.24：256-60），認(rèn)為化學(xué)合成的DNA片段要比天然的DNA片段有更多的堿基突變概率。但其真正的化學(xué)機(jī)理還不太清楚，但可以肯定的是要保證100％不發(fā)生錯(cuò)誤是不可能的。zui近，Dr. Jacek Lubkowski 在《Nucleic Acids Research》（2002，Vol. 30, No. 10 e43） 上發(fā)表了一篇文章也證實(shí)了化學(xué)合成引物（非人為錯(cuò)誤）會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤，而且引物鏈越長(zhǎng)，錯(cuò)誤概率越高。原文如下：while this method is simple in principle, in practice numerous complications can lead to errors in the synthesis. To reduce the possibility of errors during oligonucleotide synthesis, the oligonucleotides should be rather short, yet they must still be long enough to provide stable priming overlaps.
三、解決的辦法:
1. 建議用高保真的高溫聚合酶，如本公司推出的Super Pfu、Pfu 、Taq plus等，保真性比Taq酶高10倍左右，可有效的減少差錯(cuò)。
2. 再挑選一個(gè)克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，一般來(lái)說(shuō)再次出現(xiàn)錯(cuò)誤的可能性就更小了。
3. 重新合成引物。
4. 將您有缺失堿基的克隆送到我們基因部，我們負(fù)責(zé)將缺失的堿基進(jìn)行點(diǎn)突變，提供您所需要得正確序列。 但由于客戶(hù)的載體非常復(fù)雜和多變，我們承諾的是提供DNA損傷的來(lái)源
1.1 堿基脫落形成AP位點(diǎn)
熱和酸等都可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落，形成AP位點(diǎn)（Apurinic orApyrimidinic site ）。
烷化鳥(niǎo)嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上無(wú)堿基的位點(diǎn)。
1.2 堿基的改變
①物理因素
電離輻射可引起其它物質(zhì)產(chǎn)生自由基，從而引起堿基氧化修飾、過(guò)氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。
一般嘧啶比嘌呤更敏感。
②化學(xué)因素
a. 烷化劑
*、甲烷磺酸甲酯（MMS）等烷化劑可將烷基加到嘌呤或嘧啶的N或O上使堿基烷基化。
鳥(niǎo)嘌呤的N7和腺嘌呤的N3zui容易受攻擊，形成m7G和m3A烷基化的嘌呤堿基，導(dǎo)致復(fù)制時(shí)堿基錯(cuò)配。
例如鳥(niǎo)嘌呤N7被烷化后會(huì)與T配對(duì)，結(jié)果會(huì)使G-C轉(zhuǎn)變成A-T。
b. 堿基類(lèi)似物
5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。它們的結(jié)構(gòu)與堿基相似，進(jìn)入細(xì)胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復(fù)制合成。
如5-BU與T結(jié)構(gòu)相似，在酮式結(jié)構(gòu)時(shí)與A配對(duì)；它更易成為烯醇式結(jié)構(gòu)與G配對(duì)，在DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致A-T轉(zhuǎn)換為G-C。
c. 黃曲霉素
黃曲霉素B、1,2-乙酰-氨基芴、苯并芘、吖啶等可插入堿基序列，引起移碼。
d. 硝酸鹽
亞硝酸鹽能使C脫氨變成U，經(jīng)過(guò)復(fù)制就可使DNA上的G-C變成A-T對(duì)。
③堿基的自發(fā)改變和損傷
a. 堿基的異構(gòu)互變
4種堿基各自的異構(gòu)體間都可自發(fā)地互變（烯醇式與酮式間的互變），這會(huì)使堿基間發(fā)生錯(cuò)配，使A-C、T-G等。
b. 堿基的脫氨基作用
堿基的環(huán)外NH2有時(shí)會(huì)自發(fā)脫落，使C→U、A→次黃嘌呤（I）、G→黃嘌呤（X）等，DNA復(fù)制時(shí)，U-A、I-X、I-C配對(duì)，導(dǎo)致子代DNA序列錯(cuò)誤。
5-甲基胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生T（引起C-G→T-A的變化），而C脫氨基產(chǎn)生U（它通常被移出或被C代替）。
④氧自由基傷害
細(xì)胞代謝副產(chǎn)物O2-、H2O2等會(huì)造成堿基損傷，產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，引起堿基配對(duì)錯(cuò)誤。
1.3 堿基插入或缺失
吖啶類(lèi)分子帶正電呈扁平狀，易于嵌入DNA堿基平面間，導(dǎo)致在復(fù)制或重組過(guò)程中缺失或插入一個(gè)堿基。
DNA聚合酶在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生滑動(dòng)，尤其在連續(xù)幾個(gè)相同堿基的區(qū)段產(chǎn)生1個(gè)或幾個(gè)堿基的缺失或插入。聚合酶在模板鏈上滑動(dòng)易于造成缺失，在生長(zhǎng)鏈上滑動(dòng)易于造成插入。
插入或缺失會(huì)導(dǎo)致讀碼框改變。
1.4 嘧啶二聚體
DNA受到紫外線(xiàn)照射時(shí)，使DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價(jià)鍵連成二聚體。
相鄰2個(gè)T；或2個(gè)C；或C與T間都可形成環(huán)丁基二聚體；相鄰2個(gè)T間zui易形成TT二聚體。
1.5 DNA鏈斷裂
電離輻射可使DNA鏈斷裂；射線(xiàn)的直接和間接作用都可能使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開(kāi)而致DNA鏈斷裂。
烷化劑也可使DNA鏈斷裂；DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧易被烷化，結(jié)果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，在糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNA鏈斷裂。
對(duì)單倍體細(xì)胞一個(gè)雙鏈斷裂就是致死性事件。